距离第一只体细胞克隆猪的报道已有8年有余。然而，8年多的时间过去，相对于牛来讲，体细胞核移植技术（Somatic Cell Nuclear Transfer, SCNT）在猪上的应用仍不够成熟。在克隆猪中仍出现由供体细胞核翻译解码错误或解码过程中重新编程错误而导致的死胚或者婴儿畸形等现象。近年来，随着相关技术的改造与提升，体细胞核移植技术的准确率有了大幅提高。目前，体细胞核移植技术已成熟运用到科学和商业领域，主要涉及器官移植、人体遗传性疾病模型研究和医学研究等各方面。本文主要就猪克隆技术特点及应用前景作简要概述。
关键字：猪，体细胞，核移植，卵母细胞和胚胎
前言
目前，已成功运用体细胞核移植技术克隆了多种哺乳动物后代。然而，这一技术的成功率仍然很低，导致该项技术失败的原因尚未明了，相对于其他物种，猪体细胞核移植失败现象尤其突出。这是因为猪卵母细胞和胚胎对应急源和由体细胞核移植过程中导致的物理、化学因素的改变非常敏感。猪卵母细胞的细胞质内含有许多对环境压力感受非常敏感的脂肪粒。由此来看，猪卵母细胞胞质内的脂质含量对猪胚胎体细胞核移植的成败起到关键性作用。此外，国内外很多研究结果证实卵母细胞激活情况、胚胎培养和转移水平以及早期胚胎发育阶段是影响猪体细胞核移植成败的关键因素。对猪这一物种来讲，体细胞核移植技术的转移成功率以及具体实践应用仍需进一步完善，例如，能否利用转基因克隆猪进行异种器官移植等，还需要进一步的细致研究。
本文主要对猪体细胞核移植技术的主要内容和相关技术措施作简要概述。
猪卵母细胞体外成熟（IVM）
在体细胞核移植技术过程中，卵母细胞主要作为受体细胞质提供者。大多数的受体卵母细胞来源于体外成熟培养少数来自体内。已有2例报道称应用猪体内成熟卵母细胞进行体细胞核移植完全有效，并证实可运用猪体内成熟卵母细胞进行核移植并成功克隆出仔猪。还有报道称可以采用来自屠宰场的卵巢内的体外成熟卵母细胞进行克隆仔猪。
北卡罗来纳州立大学（NCSU）的研究学者比对了组织细胞培养液-199（TCM-199）与猪成熟卵母细胞的细胞质的营养成分，证实两者在猪胚胎克隆方面没有差异。许多学者致力于通过修改培养基组成与完善培养条件用以提高卵母细胞和胚胎的发育能力，从而提高克隆胚胎在体外的成活率。目前，较常用的猪卵母细胞的培养基为NCSU-23和NCSU-37。
在体外成熟培养过程中，猪卵泡液（PFF）用于补充到IVM培养基内。PFF具有较高的自由基清除能力，加入到猪成熟卵母细胞培养基内，可以保护卵母细胞免受氧化应激的影响，从而为卵母细胞受精后提供更好的生存环境。添加PFF的培养基可以提高仔猪的成活率。因为卵泡液内的营养成分对猪卵母细胞的成熟起到促进作用。但是PFF易受到许多未知的病毒性的病原体的侵染。
添加的激素、生长因子、维生素、能量物质、无机化合物、细胞因子和卵泡液等在很大程度上影响了猪卵母细胞的成熟和发育。有报道称表皮生长因子（EGF）在猪卵母细胞的细胞核和细胞质成熟过程中发挥着重要作用。此外，卵丘卵母细胞复合体（COCs）和丁酰环磷酸腺苷（dbcAMP）在猪卵母细胞的成熟发育过程中起到很好的促进作用。然而近年来，猪胚胎体外培养逐渐使用单一培养基，因为胚囊内含有猪配子介质（PGM）和受精卵介质（PZM）。这些介质是输卵管液的组成成分，并在胚胎发育的不同阶段进行补充，因此可以很好地用于配子受精，胚胎的体外成长及发育。
体细胞核移植
供体细胞的细胞核转移至卵母细胞内，这一过程被称为核移植。Prather在1989年首次应用体细胞核移植技术克隆出猪。他们应用原核细胞成功取代了合子和胚胎细胞作为供体细胞。在体外培养条件下，通过电转移的方式将授体细胞和卵母细胞进行融合，然后将融合细胞转移至输卵管内进行胚胎培养。胚泡时期的胚胎被转移至受体内继续生长发育。实验过程中，共进行了7枚原核细胞的转移和一枚卵裂4细胞时期的转移。此外，Polejaeva在2000年也有关于应用体细胞核移植技术成功克隆猪的报道。试验中应用颗粒细胞作为供体细胞，采用2阶段移植技术分阶段进行核移植。第一阶段，供体细胞核融合到去核的卵母细胞内。第二阶段类原核结构形成后转移至体内培养，形成去核合子。然而，利用单个细胞进行体细胞核移植成功克隆猪的案例仅局限于几个实验室，该技术仍有待完善。
许多学者利用不同种类的供体细胞也成功获得了克隆猪。他们致力于完善供体细胞以提高核移植的精确性。体细胞核移植的供体细胞可分为同步供体细胞和非同步供体细胞。主要区别在于是转移至体内成熟卵母细胞还是体外成熟卵母细胞。供体细胞进入受体细胞的细胞质可通过多种途径进行，例如：显微注射、电转移等方式可将供体细胞成功导入。近年来，透明带技术作为细胞融合的新技术，越来越受瞩目。
人工激活
在胚胎克隆过程中，激活在构卵母细胞和供体细胞过程中发挥重要作用。由于在体细胞核移植过程中，精子介导失活，需要人工介导启动胚胎发育。大多数的哺乳动物，卵母细胞在完成排卵和完整的减数分裂后的中期Ⅱ进行介导。该过程受MPF活性控制。减数分裂过程中，精子诱导可以通过信号转导途径释放钙、镁等促进因子，这些活性因子可以使细胞内的游离钙离子浓度短暂上升，从而诱导卵母细胞激活。
在猪胚胎体外培养过程中，卵母细胞体外成熟大约需要42-44h，在这一过程中，钙离子的瞬间激变有效促进了成熟过程。一般采用电、化学和机械的方式刺激卵母细胞。该刺激/抑制作用作用于α-1，3 - 半乳糖基转移酶的基因，在电刺激的作用下，该基因被抑制或激活，从而生产出含有荧光蛋白的转基因猪。通常情况下，高电压直流脉冲可使胞外钙离子内流。
当胞外钙离子浓度较低时，直流脉冲诱导膜融合。在这种情况下，卵母细胞内高水平的成熟促进因子（MPF）打破融合障碍，促进早期染色体缩合。在这种化学反应过程中，卵母细胞会释放细胞松弛素B以抑制第二极体的出现，释放蛋白抑制剂Cycloheximide以抑制蛋白激酶与钙离子形成络合物，引发钙离子内流。
于此同时，在秋水仙素的作用下，有效去核后，可通过显微注射的方式将供体细胞核注入寄主细胞质内。当供体细胞染色体与受体卵母细胞细胞质有效融合后，核重组开始。所有的激活方式都是通过诱发钙离子浓度改变实现的，然而目前情况下，诱导猪卵母细胞激活的方法非常有限。
胚胎培养和移植
在组织胚胎培养过程中，需要选取处于1-细胞和8-细胞阶段之间的多个早期胚胎转移至受体细胞内，以提高转移精确率。一个受体细胞大约需要转移100枚以上胚胎以避免体外培养系统等外界因素影响，而且这种影响在猪这一物种中更为常见。因此，克隆猪受孕率很低，很多胎儿在怀孕期间流产。
对转入受体细胞前胚胎的培养基成分已有大量的报道研究，很多学者致力于通过改善该培养基成分来提高转入胚胎的成活率。目前使用的猪胚胎培养基为NCSU-23、NCSU-37和（PZM）-3。近来研究结果显示，PZM-3能更好的促进猪培养的生长，尤其对利用体细胞核移植的猪胚胎更为有益。另外有报道称在NCSU-23中含有牛血清白蛋白（BSA）和聚乙烯醇（PVA），这两者对提高胚胎的成活率具有显著影响。在胚胎培养过程中，研究结果显示，猪胚胎处于含有5%CO2中时胚囊发育率和总细胞数明显高于处于5%CO2，5％O2和90％N2培养条件下。最近有报道显示低氧气浓度可促进猪胚胎在体外条件下的发育。然而，体外受精时，低氧和高氧浓度条件下，胚胎发育总细胞数和细胞凋亡数没有显著差异。
此外，在猪体细胞核移植过程中，胚胎培养基内添加血小板活化因子、表皮生长因子等可显著增加猪胚胎囊胚发育率和总细胞数。鉴于培养基体系在克隆胚胎过程中的重要影响，还需要大量的试验来探究最佳培养基组成，以寻求最好的体外培养条件。
妊娠和产仔
尽管在体外环境下克隆猪已取得成功，但相对于牛、羊和小鼠来讲，克隆猪的整体效率依然很低。胎盘异常等原因均可导致体细胞核移植技术妊娠失败，常见有以下几种原因：血管形成较少、上皮细胞发育不全和基底膜发生改变等等。猪体外胚胎培养条件下，妊娠可通过正常方式进行。不同物种直接由于内在差异或者胚胎转化方式不同，妊娠率有所不同。此外，每次产仔数的多少也会对胚胎的生长发育情况有所影响。相对于其他物种，猪胚胎转移至受体内的数目非常多。通常需要50-150枚猪胚胎在1-细胞、4-细胞或4-8细胞时期转移至一个受体内。对猪来讲，需要3枚以上的胚胎维持妊娠需要。在体细胞核移植过程中，传导信号较弱，需要在配种阶段或者胚胎培养过程中采用激素注射等方式提高克隆猪的成活率。
猪体细胞核移植的应用
猪体细胞核移植主要应用于生物医学领域，鉴于猪和人类在器官形状、解剖学和生理学方面的相似性，猪器官可用于人类或其他物种的异种器官移植，也可作为人类疾病的动物模型。此外，与小鼠相比，猪的基因组更接近于人类，其基于表达模式与人类基于表达高度类似。然而克隆猪器官在移植到人类时，会产生免疫应答等应激现象，因此还需要不断的研究与试验用以完善猪体细胞核移植。目前，猪体细胞核移植只是在实验室完成，具体应用的可行性和应用方式等还需要进一步探讨。