猪流行性腹泻(PED)是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的猪病毒性腹泻疫病，是严重危害养猪业的重要疫病之一，给世界各国的养猪业造成了巨大经济损失。山东惠民县某养猪场发生了以哺乳仔猪水样腹泻、并伴有呕吐等特征的疑似猪流行性腹泻疾病，现将诊治过程报告如下。
1、发病情况
发现有哺乳仔猪(3-21 日龄)呕吐、腹泻、脱水。同圈仔猪发病率达100%，不同圈发病仔猪死亡率在11.1%-30.0%。用抗生素治疗无效。
2、临床症状
发病哺乳仔猪普遍精神沉郁，食欲下降，水样腹泻、个别仔猪伴有呕吐，仔猪普遍偏瘦，但体温正常。
3、病理变化
剖检病死仔猪发现：小肠扩张、肠壁变薄，肠内充满黄色液体，肠系膜淋巴结水肿。
4、病毒分离鉴定
4.1 病料采集
取病死仔猪小肠黏膜、内容物及水样腹泻粪便作为分离病毒的样品，将样品冷冻保存。
4.2 病料处理
将采集的样品用灭菌PBS 研磨，反复冻融，在4 ℃条件下3000 r/min离心30 min、吸取上清，将上清液用0.22μm 一次性滤器过滤除菌、分装保存于-80 ℃备用。
5、病毒的RT-PCR 鉴定
5.1 引物设计
根据GenBank JN825712.1 序列设计，扩增长度661 bp，用于鉴定猪流行性腹泻病毒。引物序列如下：上游引物：CGGTTCTATTCCCGTT下游引物：GAAGCACTTTCTCACTATC
5.2 病毒的RT-PCR
提取病料的RNA， 并同时提取PEDV 阴性对照( 细胞培养液) 及PEDV 阳性细胞毒的RNA。病毒RNA用宝生物工程( 大连) 有限公司提供的RNA 提取试剂盒提取，一步法RTPCR反应成分及反应程序如下。
RT-PCR 反应体系为：10 Buffer 5μL，MgCl2(25mmol/L) 10μL，dNTPs(10 mmol/L) 5μL，Rn a s e I n h i b i t o r ( 4 0 U/μL) 1μL，A M V R T a se X L ( 5 u / μ L ) 1 μ L ，AMV-Optimized Taq(5 U/μL) 1μL，上游引物P1(20μmol/L)1μL， 下游引物P2(20μmol/L)1μL ， 模板5μL，RNase Free ddH2O up to 50μL。
RT-PCR 反应条件为：50 ℃反转录1 h ;94 ℃ 5 min ;进入PCR 循环，94 ℃ 45 S，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35 个循环后，72 ℃延伸10 min。反应结束后，用0.8% 琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。
5.3 病毒的RT-PCR 鉴定结果
琼脂糖凝胶电泳检测显示，病毒的RT-PCR 扩增产物大小约660 bp，与预期一致(如图1 所示)。回收RTPCR产物，送往上海生物工程有限公司测序。测序结果与GenBank 上报道的猪流行性腹泻病毒序列同源性在96%-99% 之间。
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